WB实验操作过程中，你有没有遇到各种意想不到的问题影响实验结果和数据呢？

要解决这些问题，首先要了解WB实验的基本原理和流程：

作为一种蛋白分析技术，WB常用于对蛋白进行定性和半定量分析，通过“蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱”这么一个过程，形成蛋白+一抗+二抗这样一个复合物，加以化学发光液之后，有靶蛋白的位置就会产生荧光，然后再利用者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。

我们可以从这个实验流程中来查找解决遇到的问题，比如：

01marker电泳完形状正常但转完膜出现涣散?

一般是因为胶跟膜贴合不够紧密。有些三明治夹用久了会变形，一般是中部向外凸，导致夹得不够紧。如果三明治夹未发生明显变形，有可能是海绵用久了，可以加多点滤纸或者多加一层海绵。

02条带不整齐、畸形、拖尾?

(1)可能是由于胶凝固不均匀，建议待胶完全凝固后上样。

(2)可能是有气泡在胶的下边缘，建议电泳前，检查凝胶避开有气泡的位置上样。

(3)转膜过程中胶与膜中间有气泡，建议转膜时充分排除气泡，多检查几遍。

(4)条带拖尾，应该是蛋白杂质较多。

03显影后条带“两端粗中间细”?

(1)转膜没做好散热，由于转膜槽中心部离外槽的冰块或者冰水混合物最远，故中心部散热最差，导致中心部蛋白转膜效率下降。

(2)孵抗体时，未充分覆盖膜，比如中间有气泡、膜不平整。

(3)活化前中间部膜被污染过，导致该部位的正电荷被中和了一部分。

04显影后各样本蛋白连成一条线?

上样量过多所致。

05泳道背景高?

常见原因是一抗特异性不好、一抗二抗浓度过高、蛋白提取不纯、封闭不足、清洗不充分等。建议降低一抗浓度、孵育时间以及缩短二抗孵育时间，增加封闭液浓度和封闭时间，增加膜的洗涤次数、时间或严格程度。

06条带信号太低甚至无信号?

可能是上样量不足、样品的问题、蛋白提取不充分，也可能是抗体问题，过期或者稀释浓度太高，洗涤过程中蛋白被从膜上洗掉。

建议利用丽春红对膜染色，若有条带在，则进一步排查抗体问题，若没有观察到条带，则是样品问题。

07孵完抗体的膜想要再次孵育新的抗体又不想再次转膜怎么办?

可以使用博鹭腾蛋白印迹膜再生液(WS001)进行洗脱，用于去除结合在蛋白印迹膜(PVDF 膜或 NC膜)上的一抗和二抗的洗涤液。在不影响目的蛋白的情况下，可使同一张蛋白印迹膜进行多次抗体检测，省去反复电泳和转膜等步骤，操作简单快速。

如果想要尽可能地规避以上问题，更高效地完成实验流程，得出精准的实验数据，推荐使用博鹭腾WB-600Auto 全自动蛋白印迹处理系统。

您只需将转印蛋白后的膜放到系统中，准备相应的试剂（兼容常规试剂，无专用试剂），并设定程序， WB-600Auto 将自动完成 WB 实验中对蛋白膜的封闭、洗膜、孵育等过程。原本需要4个小时的实验，现在只需要5分钟即可完成。封闭液等昂贵试剂还可实现自动回收、冷藏，实现重复利用，节约试剂成本。

它还拥有多达 30 个可独立运行的液体泵，可同时进行最多6块膜的处理，每个通道可放置不同规格的样品槽位，可独立设置程序运行，预设不同的实验方案，大大提高工作效率，满足多个实验者同时使用的需求，真正实现高通量。

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